練習(xí)1：編輯線粒體DNA序列

選擇包含來(lái)自線粒體DNA控制區(qū)域的原始序列數(shù)據(jù)的序列列表。雙擊列表在新窗口中打開(kāi)它。在序列視圖右側(cè)的常規(guī)選項(xiàng)卡中，選擇根據(jù)質(zhì)量顯示顏色。這將根據(jù)該基地的序列質(zhì)量突出顯示堿基電話 - 藍(lán)色越深，質(zhì)量越低。

縮小時(shí)，您將看不到各個(gè)堿基或色譜峰，但會(huì)顯示一張圖表，顯示序列質(zhì)量。如果向下滾動(dòng)序列，您會(huì)看到每個(gè)序列結(jié)束時(shí)序列質(zhì)量顯著下降。放大至少50％，查看色譜圖在良好質(zhì)量區(qū)域和低質(zhì)量區(qū)域中的效果。其中一個(gè)序列（CLG3）沒(méi)有序列，表明測(cè)序反應(yīng)失敗，因此將其從列表中刪除。在序列變得不可讀之前，序列SRE1只有一小段高質(zhì)量的序列，因此也要?jiǎng)h除這一序列。保存編輯后的序列列表并關(guān)閉窗口。

通過(guò)單擊注釋和預(yù)測(cè)→修剪結(jié)束來(lái)修剪序列末端的質(zhì)量較差的基礎(chǔ)。選擇“從序列中刪除新的修剪區(qū)域”，并將錯(cuò)誤概率限制設(shè)置為0.01，如下面的屏幕截圖所示。點(diǎn)擊確定，然后在修整完成后保存。

從這里開(kāi)始清理和編輯序列一旦對(duì)齊后，效率會(huì)更高。再次選擇序列列表（Cyanistes CR序列），然后單擊對(duì)齊/組裝→多重對(duì)齊。選擇MUSCLE?對(duì)齊算法并使用默認(rèn)設(shè)置運(yùn)行它。

雙擊對(duì)齊將其打開(kāi)并放大到約50％，以便可以看到堿基調(diào)用和色譜圖。您可能需要檢查顯示圖形的圖形選項(xiàng)卡中才能看到的色譜圖。滾動(dòng)到3'末端的堿基，您會(huì)看到在GGGGGGGGAAGGGGGGGGG motif之后堿基調(diào)用變?nèi)酰ㄕ?qǐng)參閱下面的截圖）。在許多序列中，這個(gè)主題之后的區(qū)域已經(jīng)被刪除。通過(guò)單擊允許編輯來(lái)修剪剩余的序列，然后從共同序列的堿基563開(kāi)始選擇堿基并敲擊刪除鍵。編輯共有序列會(huì)將更改應(yīng)用于對(duì)齊中的所有序列。您還應(yīng)該刪除比對(duì)開(kāi)始時(shí)的前20個(gè)堿基，以使序列長(zhǎng)度相同，因?yàn)樵搮^(qū)域已在多個(gè)序列中被刪除。

單擊保存并在詢問(wèn)您是否要將更改應(yīng)用于原始序列時(shí)選擇是。請(qǐng)注意，如果要保留原始原始數(shù)據(jù)文件，有時(shí)最好不要將更改應(yīng)用于原始序列。

現(xiàn)在可以使用Geneious中的Tree?函數(shù)，利用這種比對(duì)來(lái)構(gòu)建這些序列的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)。有關(guān)構(gòu)建和解釋系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的更多信息，請(qǐng)參閱我們網(wǎng)站上提供的Geneious系統(tǒng)發(fā)育分析教程。

練習(xí)2：處理雙向核子序列數(shù)據(jù)

本練習(xí)將為您提供更多練習(xí)處理和編輯Sanger測(cè)序產(chǎn)生的原始序列數(shù)據(jù)。

Acrocephalus序列列表包含來(lái)自3種不同尖頭war鶯物種的核基因的正向和反向序列。序列用三個(gè)字母的代碼來(lái)命名，以表明它們的物種（aru =?A. arundinaceus，大蘆葦鶯; dum =?A. dumetorum，Blyth's reed warbler;或=?orientalis，Oriental reed warbler），并用'F'或'R'來(lái)表明它們是用正向引物還是反向引物進(jìn)行測(cè)序。

雙擊Acrocephalus序列列表以在新窗口中打開(kāi)它。向下滾動(dòng)以獲得序列的概述。請(qǐng)注意，在一些序列中，序列質(zhì)量會(huì)下降（例如dum2和dum4序列）。

通過(guò)單擊注釋和預(yù)測(cè)→修剪結(jié)束來(lái)修剪序列末端的質(zhì)量差序列。這次我們將注釋修剪區(qū)域而不是完全刪除它們，所以選擇“注釋新修剪區(qū)域”。將錯(cuò)誤概率限制設(shè)置為0.01，然后單擊確定。修剪完成后保存順序列表并關(guān)閉順序列表窗口。

我們現(xiàn)在需要從列表中提取序列文件以設(shè)置讀取方向并使用雜合子查找程序，因?yàn)檫@些選項(xiàng)在序列列表中不起作用。選擇Acrocephalus序列列表并單擊序列→從列表中提取序列。選擇將序列保存在稱為Acrocephalus序列的子文件夾中。

我們現(xiàn)在將在各個(gè)序列文件上運(yùn)行Heterozygote Finder，以識(shí)別并注釋在相同位置上調(diào)用兩個(gè)不同核苷酸的堿基。由于這些核序列均代表兩個(gè)等位基因，所以可能存在兩個(gè)等位基因具有不同堿基且存在雙色譜峰的雜合位置。選擇Acrocephalus Sequences文件夾中的所有文件并單擊Annotate and Predict→Find Heterozygotes?。取消選中已修整區(qū)域中的搜索，因?yàn)樾蛄匈|(zhì)量差的區(qū)域不會(huì)給出準(zhǔn)確的結(jié)果。將峰相似性設(shè)置為50％，并選擇注釋雜合體堿基。

點(diǎn)擊確定并在分析完成后保存序列。在我們組裝正向和反向序列之后，我們將回到被標(biāo)注為雜合體的堿基。

我們現(xiàn)在將為每個(gè)人組裝正向和反向序列。為確保序列在每一對(duì)中以相同方向組裝，我們首先需要設(shè)置讀取方向。按住命令/ cntrl鍵，選擇文件夾中的所有轉(zhuǎn)發(fā)序列（以F作為最后一個(gè)字母命名），然后選擇序列→設(shè)置讀取方向。選中Forward?框并點(diǎn)擊OK?。不需要設(shè)置反向讀取的方向。

現(xiàn)在選擇文件夾中的所有序列，然后選擇對(duì)齊/組裝→De Novo組裝。點(diǎn)擊Assemble by?，然后選擇名稱的第一部分，用下劃線分隔。這將為每對(duì)正向和反向序列產(chǎn)生一個(gè)重疊群。將靈敏度設(shè)置為最高靈敏度/慢速，并確保保存裝配報(bào)告，保存未使用讀數(shù)的列表，保存子文件夾并保存重疊群。選擇使用現(xiàn)有修剪區(qū)域- 使用此選項(xiàng)，匯編器將忽略注釋為修剪的區(qū)域，但您仍然能夠在序列中看到這些區(qū)域。點(diǎn)擊好的。

現(xiàn)在已創(chuàng)建一個(gè)名為Assembly的子文件夾，其中包含重疊群和Assembly報(bào)告。您還會(huì)看到未使用的讀取序列列表，其中包含無(wú)法組合的序列。看看這個(gè)序列列表，你會(huì)發(fā)現(xiàn)這些序列只包含一小段優(yōu)質(zhì)序列（dum2和dum4）。