練習1：編輯線粒體DNA序列

選擇包含來自線粒體DNA控制區域的原始序列數據的序列列表。雙擊列表在新窗口中打開它。在序列視圖右側的常規選項卡中，選擇根據質量顯示顏色。這將根據該基地的序列質量突出顯示堿基電話 - 藍色越深，質量越低。

縮小時，您將看不到各個堿基或色譜峰，但會顯示一張圖表，顯示序列質量。如果向下滾動序列，您會看到每個序列結束時序列質量顯著下降。放大至少50％，查看色譜圖在良好質量區域和低質量區域中的效果。其中一個序列（CLG3）沒有序列，表明測序反應失敗，因此將其從列表中刪除。在序列變得不可讀之前，序列SRE1只有一小段高質量的序列，因此也要刪除這一序列。保存編輯后的序列列表并關閉窗口。

通過單擊注釋和預測→修剪結束來修剪序列末端的質量較差的基礎。選擇“從序列中刪除新的修剪區域”，并將錯誤概率限制設置為0.01，如下面的屏幕截圖所示。點擊確定，然后在修整完成后保存。

從這里開始清理和編輯序列一旦對齊后，效率會更高。再次選擇序列列表（Cyanistes CR序列），然后單擊對齊/組裝→多重對齊。選擇MUSCLE?對齊算法并使用默認設置運行它。

雙擊對齊將其打開并放大到約50％，以便可以看到堿基調用和色譜圖。您可能需要檢查顯示圖形的圖形選項卡中才能看到的色譜圖。滾動到3'末端的堿基，您會看到在GGGGGGGGAAGGGGGGGGG motif之后堿基調用變弱（請參閱下面的截圖）。在許多序列中，這個主題之后的區域已經被刪除。通過單擊允許編輯來修剪剩余的序列，然后從共同序列的堿基563開始選擇堿基并敲擊刪除鍵。編輯共有序列會將更改應用于對齊中的所有序列。您還應該刪除比對開始時的前20個堿基，以使序列長度相同，因為該區域已在多個序列中被刪除。

單擊保存并在詢問您是否要將更改應用于原始序列時選擇是。請注意，如果要保留原始原始數據文件，有時最好不要將更改應用于原始序列。

現在可以使用Geneious中的Tree?函數，利用這種比對來構建這些序列的系統發生樹。有關構建和解釋系統發育樹的更多信息，請參閱我們網站上提供的Geneious系統發育分析教程。

練習2：處理雙向核子序列數據

本練習將為您提供更多練習處理和編輯Sanger測序產生的原始序列數據。

Acrocephalus序列列表包含來自3種不同尖頭war鶯物種的核基因的正向和反向序列。序列用三個字母的代碼來命名，以表明它們的物種（aru =?A. arundinaceus，大蘆葦鶯; dum =?A. dumetorum，Blyth's reed warbler;或=?orientalis，Oriental reed warbler），并用'F'或'R'來表明它們是用正向引物還是反向引物進行測序。

雙擊Acrocephalus序列列表以在新窗口中打開它。向下滾動以獲得序列的概述。請注意，在一些序列中，序列質量會下降（例如dum2和dum4序列）。

通過單擊注釋和預測→修剪結束來修剪序列末端的質量差序列。這次我們將注釋修剪區域而不是完全刪除它們，所以選擇“注釋新修剪區域”。將錯誤概率限制設置為0.01，然后單擊確定。修剪完成后保存順序列表并關閉順序列表窗口。

我們現在需要從列表中提取序列文件以設置讀取方向并使用雜合子查找程序，因為這些選項在序列列表中不起作用。選擇Acrocephalus序列列表并單擊序列→從列表中提取序列。選擇將序列保存在稱為Acrocephalus序列的子文件夾中。

我們現在將在各個序列文件上運行Heterozygote Finder，以識別并注釋在相同位置上調用兩個不同核苷酸的堿基。由于這些核序列均代表兩個等位基因，所以可能存在兩個等位基因具有不同堿基且存在雙色譜峰的雜合位置。選擇Acrocephalus Sequences文件夾中的所有文件并單擊Annotate and Predict→Find Heterozygotes?。取消選中已修整區域中的搜索，因為序列質量差的區域不會給出準確的結果。將峰相似性設置為50％，并選擇注釋雜合體堿基。

點擊確定并在分析完成后保存序列。在我們組裝正向和反向序列之后，我們將回到被標注為雜合體的堿基。

我們現在將為每個人組裝正向和反向序列。為確保序列在每一對中以相同方向組裝，我們首先需要設置讀取方向。按住命令/ cntrl鍵，選擇文件夾中的所有轉發序列（以F作為最后一個字母命名），然后選擇序列→設置讀取方向。選中Forward?框并點擊OK?。不需要設置反向讀取的方向。

現在選擇文件夾中的所有序列，然后選擇對齊/組裝→De Novo組裝。點擊Assemble by?，然后選擇名稱的第一部分，用下劃線分隔。這將為每對正向和反向序列產生一個重疊群。將靈敏度設置為最高靈敏度/慢速，并確保保存裝配報告，保存未使用讀數的列表，保存子文件夾并保存重疊群。選擇使用現有修剪區域- 使用此選項，匯編器將忽略注釋為修剪的區域，但您仍然能夠在序列中看到這些區域。點擊好的。

現在已創建一個名為Assembly的子文件夾，其中包含重疊群和Assembly報告。您還會看到未使用的讀取序列列表，其中包含無法組合的序列。看看這個序列列表，你會發現這些序列只包含一小段優質序列（dum2和dum4）。